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環介導等溫擴增技術在病原微生物快速檢測中的研究進展

發布時間:2020-02-13所屬分類:醫學論文瀏覽:1

摘要:病原微生物是危害人類健康的最主要影響因素之一,快速、準確地鑒定病原微生物對保障人類健康具有重要意義。環介導等溫擴增技術(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是一種新型的等溫核酸擴增技術,具有特異性高、靈敏度高、快速、經濟、簡便的優

  摘要:病原微生物是危害人類健康的最主要影響因素之一,快速、準確地鑒定病原微生物對保障人類健康具有重要意義。環介導等溫擴增技術(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是一種新型的等溫核酸擴增技術,具有特異性高、靈敏度高、快速、經濟、簡便的優點?梢耘c其他新技術結合,彌補其引物設計困難和易被污染的不足,使其能夠在更多領域應用,尤其是在資源貧乏地區的基因檢測以及食品的快速檢測和基層檢測。本文就環介導等溫擴增的基本原理、特點及在病原微生物檢測中的應用對近些年的研究進展進行綜述,并對環介導等溫擴增未來發展方向進行展望,為環介導等溫擴增技術的進一步發展提供參考。

環介導等溫擴增技術在病原微生物快速檢測中的研究進展

  關鍵詞:環介導等溫擴增;病原微生物;基本原理;快速檢測;基層檢測

  1引言

  我們生活在微生物的時代,微生物影響著我們生活的方方面面。我們一方面享受著微生物帶來的便利,如品嘗著醇香的白酒,享用著美味的奶酪等。另一方面,我們也飽受微生物的困擾,由各種微生物帶來的食物中毒,病菌感染時刻威脅著我們的身體健康,這些能夠引起人類或動物疾病的微生物又被稱為病原微生物,它包括病毒、細菌、真菌、原生動物等[1]。它們可以通過空氣、食物等途徑傳播且傳播速度極快[2]。因此,對病原微生物進行快速的檢測能夠讓我們提前發現并解決其帶來的危害。在過去的幾十年里,病原微生物檢測和鑒定方面取得了巨大進步,現有的檢測方法主要有傳統培養法、免疫學檢測方法、分子生物學檢測方法,以及以此類方法為基礎、多學科交叉發展起來的新型檢測技術,如傳感器技術、生物芯片技術等。傳統培養法檢測結果相對精確,但耗時太長,若同時檢測大量樣品,工作量大且效率不高。免疫學檢測方法檢測結果靈敏度高,特異性強,檢測時間相對較短,但依賴于昂貴的檢出設備,難以普及至基層檢測。分子生物學檢測方法中聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse-transcription-polymerasechainreaction,RT-PCR)、實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(real-timepolymerasechainreaction,real-timePCR)等是現在應用較廣的檢測技術,但這些方法較為繁瑣或是依賴于較昂貴的設備,難以適用于現場檢測。

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  環介導等溫擴增技術(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等[3]開發的一種等溫核酸擴增技術。它依靠2對引物,在恒定的溫度(61~65℃),在具有高鏈置換活性的DNA聚合酶作用下,以脫氧核糖核苷三磷酸為原料進行DNA合成反應。反應能在1h內完成,具有快速、簡易、高特異性,不依賴于昂貴檢測設備的優點[4],使其能夠用于資源貧乏地區的基因檢測、食品和環境樣品的快速檢測及現場檢測。本文就LAMP的原理、特點及近些年的發展及應用進行綜述,并對其未來發展作出展望,為環介導等溫擴增技術的進一步發展提供參考依據。

  2環介導等溫擴增技術原理、特點及應用

  2.1基本原理

  LAMP的引物數量一般是4~6條。在設計時,先確定目標基因上的6個特異性區域F3、F2、F1、B1、B2、B3(圖1),F1c和B1c的熔解溫度(Tm)一般在64~66℃,F2、B2、F3、B3的Tm一般為59~61℃,然后依據這6個特異性區域設計4條引物:正向內引物(forwardinnerprimer,FIP),由F1c和F2組成;反向內引物(backwardinnerprimer,BIP),由B1c和B2組成,中間均以TTTT作為間隔,內引物長度一般在30~44個堿基;外引物F3、B3分別由目的基因上的F3、B3區域組成,長度一般為15~20個堿基。Nagamine等[5]提出增加一對促環引物LF和LB參與反應,可以提高擴增效率,將反應時間縮短三分之一甚至二分之一。

  LAMP主要有3個階段,第一階段,模板合成階段,在LAMP反應體系中,內引物的濃度幾倍于外引物的濃度,因此,內引物會先與模板鏈結合合成互補鏈,形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結合,形成DNA雙鏈,在BstDNA聚合酶的作用下,釋放出由內引物合成的互補鏈,該互補鏈經過一系列反應最終形成具有啞鈴結構的DNA單鏈,該單鏈是后續循環擴增的模板。第二階段,循環擴增階段,以啞鈴結構DNA單鏈自身為模板依據第一階段的反應原理不斷形成一端開口的過渡性莖環結構DNA。該DNA鏈作為第三階段的反應模板。第三階段,延長和再循環階段,由內外引物引導過渡性莖環結構DNA不斷發生鏈置換延伸反應,最后形成具有多個莖環結構和花椰菜結構的長度不一的DNA混合物[5]。

  2.2環介導等溫擴增技術特點及其發展

  2.2.1LAMP特點

  LAMP將模板加入反應體系中進行擴增,擴增結束后目視觀察即可判斷反應是否發生,步驟簡單;LAMP的等溫擴增特性使其只需一個恒溫水浴鍋就能滿足反應要求,儀器成本低;同時它也不需要進行DNA的變性及復性步驟,節省了反應時間。其次,4條引物的特異性識別,提高了擴增效率。LAMP結果觀察和產物檢測主要有3種方法,一為濁度法,LAMP反應過程中會生成焦磷酸鎂沉淀,通過觀察是否產生沉淀判斷反應是否發生,同時由于沉淀的產生會改變反應液的濁度,因此可測定實時濁度實現LAMP的定量檢測[6,7]。二為熒光檢測法。在LAMP反應體系中加入二價錳離子和鈣黃素,若反應成功擴增,在紫光燈或是日光的照射下能看到溶液顏色為明亮的綠色[8],可以實現LAMP的不開蓋可視化檢測,避免氣溶膠污染。后續研究發現,SYBRGreen染料具有比鈣黃素更高的靈敏度,向反應體系中加入相應比例的熒光染料,測定反應的實時熒光值,可實現LAMP的定量檢測。三為凝膠電泳法。將反應產物進行瓊脂糖電泳,根據是否看到階梯狀條帶判斷反應是否發生。

  2.2.2逆轉錄環介導等溫擴增

  逆轉錄環介導等溫擴增(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)基本原理與操作與常規LAMP基本相同,不同的是擴增模板使用的是RNA,需在反應開始前向體系內加入逆轉錄酶。RT-LAMP具有與LAMP相似的靈敏度和特異性。

  2.2.3多重環介導等溫擴增

  多重環介導等溫擴增(multiplexloop-mediatedisothermalamplification,multiplexLAMP)是指在單管反應體系試劑內加入幾組引物進行擴增反應,擴增產物通過酶切反應、實時熒光或是實時濁度測定實現對多種病原微生物的特異性檢驗[9]。其優點是在保證特異性和靈敏度的前提下提高檢測效率,節約試劑成本和時間成本,但也存在一些不足,首先,所需引物數量多,為避免形成引物二聚體及二級結構,發生非特異性擴增,對引物的要求變高,增加了引物設計的難度。其次,在對擴增產物進行酶切分析時,存在酶切時間長,酶切產物不單一,結果難以準確判斷以及開蓋可能造成的氣溶膠污染等問題。對擴增產物進行實時熒光或是實時濁度測定,進行熔解曲線分析能夠很好地避免氣溶膠污染以及檢測時間長的問題,但也存在儀器成本較高、操作繁瑣,不適用于基層檢測以及目前最高只能進行四重反應等問題。

  2.2.4與橫向流動裝置結合的逆轉錄環介導等溫擴增

  橫向流動裝置(lateralflowdevice,LFD)是一種基于試紙條的色譜檢測平臺,利用反應體系中異硫氰酸熒光素FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交,然后在橫向流動試紙條上進行抗原抗體結合及顯色,完成結果判斷[10]。利用LFD檢測RT-LAMP擴增后的產物,可以有效地降低假陽性概率,簡化操作步驟,同時節省時間。但其需要設計特異性探針,一定程度上增加了檢測成本。

  2.2.5微流控環介導等溫擴增

  微流控是將樣品分析從前處理到反應再到結果檢測等一系列連續操作過程整合到一個微型芯片上,從而實現分析過程自動化的一項技術。該技術可以為LAMP核酸檢測系統提供形狀、大小不同的微量密閉反應通道及微反應空間,可以較好避免氣溶膠污染,提高檢測結果準確性[11]。但它也存在不足,如靈敏度不高,DNA樣本需經過前處理富集、微流控裝置需要專門設計以及微流體材料選擇等問題。

  2.2.6乳液微滴數字分析技術與環介導等溫擴增結合

  乳液微滴數字分析技術是屬于數字核酸檢測技術dNAD的一種,主要是使用乳液密封磁珠的方法,與磁珠的單分子捕獲和磁珠原位LAMP擴增反應相結合構建一個高通量的數字核酸檢測平臺[12]。該平臺可以在1.5h內完成樣本的檢測,并且可以達到300個拷貝/mL的檢測限和實現高精度的絕對定量。

  3環介導等溫擴增反應在病原微生物檢測中的應用

  3.1LAMP在細菌快速檢測中的應用

  在細菌檢測方面,傳統的分離培養法一直是檢測的金標準,但是該方法步驟繁瑣、費時、費力,使用更簡便的檢測方法是未來的必然需求。LAMP具有快速、特異性高等優點,使其能夠應用到細菌檢測。目前,國內外已有不少關于其應用的研究。如Yano等[13]使用LAMP對腸毒素大腸桿菌進行檢測,其最低檢出限為4CFU/mL;樊粉霞等[14]利用RT-LAMP對血液樣本中的傷寒沙門氏菌進行檢測,最低檢出限為7CFU/mL,與RT-PCR比較,其靈敏度更高。在LAMP反應中,樣品中存在的死菌會影響擴增結果。與DNA相比,RNA更容易在死菌中降解,擴增結果不易出現假陽性結果。梁玉林等[15]以金黃色葡萄球菌的RNA為模板進行RT-LAMP,結果表明只要擴增檢測結果不大于107CFU/mL,就能很好地避免由于死菌擴增造成的假陽性結果。一些研究結果表明,LAMP對鮮肉[16]、奶粉和速凍水餃[17]中的金黃色葡萄球菌檢測具有較好的檢出限。Chen等[18]在提取DNA模板后,用疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide,PMA)溶液對DNA模板進行一定時間的處理,也可以很好地排除死菌的干擾,除此之外,疊氮溴化丙錠環介導等溫擴增(PMA-LAMP)檢測瓜果中的鼠傷寒沙門氏菌靈敏度比疊氮溴化丙錠-聚合酶鏈式反應(PMA-PCR)高100倍。但是PMA是一種強烈致癌物質,不適合推廣使用。Xia等[12]建立了一個基于蒙特卡羅方法、泊松統計和化學計量學理論的數學模型,并制造了一個帶有1200個均勻和離散反應室(9.6nL)的螺旋芯片,該螺旋芯片實現了核酸濃度(跨越度超過4個數量級)的定量分析,將該芯片與LAMP結合,形成數字化環介導等溫擴增(dLAMP),使用該法對病原性DNA樣品進行絕對定量,最低檢出限可達87copies/mL。金婷婷[19]將免疫捕獲技術與LAMP技術結合,使用免疫捕獲技術預處理待檢測的人工污染全脂乳,再用LAMP法檢測樣品,最低檢出限可達到8CFU/mL,而Ravan等[20]未使用該預處理技術的LMAP法的檢出限僅為103CFU/mL。其最低檢出限有了顯著提高,同時在保證檢測結果準確性的前提下,也縮短了樣品前處理時間。Connelly等[10]設計了一種基于紙質微流體的集成備,配合手持紫外燈和手機相機,對人血漿中的大腸埃希氏菌進行了半定量檢測。Tamura等[21]將擴增難治性突變系統(amplificationofrefractorymutantsystems,ARMS)與LAMP結合起來,建立了擴增難治性突變系統-環介導等溫擴增,該方法能夠對流感嗜血桿菌中的ftsI基因中的核苷酸(1578T)進行物種特異性檢測,而不擴增β-內酰胺酶陰性氨芐青霉素抗性中攜帶點突變(T1578G/A)的序列。最低檢出限為10.0pg/reaction。Feng等[22]利用寡核苷酸適配子磁捕獲技術(adaptivemuonmagneticcapture,AMC)與LAMP技術結合來實現對李斯特菌的準確、快速檢測,檢出限為5CFU/mL,整個檢測過程耗時約3h。其他應用[23-30]見表1。

  3.2LAMP在真菌快速檢測中的應用

  在真菌檢測方面,實現對真菌的快速檢測與鑒定,對診斷、治療和預防由真菌以及其代謝產物引起的疾病有重要意義。Ferrara等[31]使用LAMP法對純培養的青霉菌進行檢測,最低檢出限為102fg/reaction;Vogt等[32]使用LAMP法檢測人工污染葡萄中的草酸青霉菌,最低檢出限為100pg/reaction;Luo等[33]使用Real-timeLAMP法檢測花生樣品中的黃曲霉,通過實時濁度儀對反應液的濁度進行實時測定達到定量的目的,該法最小檢出限為102分生孢子/g;Kasahara等[34]對多條引物之間的組合進行優化,對反應液的濁度進行實時測定,成功實現了5種酵母菌的多重檢測且最小檢出限能達到100~103cells/mL。其他應用[35-42]見表1。

  3.3LAMP在病毒快速檢測中的應用

  病毒能夠引發各種人類、動物以及植物疾病。病毒在感染宿主后,通常會有一段時間的潛伏期,在這期間,病毒不會對宿主造成任何的破壞,而這段時間是我們治愈病毒性疾病的黃金時間。所以對病毒進行快速、精確的檢測在臨床方面具有重要意義。Zhong等[43]使用LAMP對臨床樣本中的人類乳頭狀瘤病毒進行檢測,最低檢出限為1000copies/reaction;Curtis等[44]用RT-LAMP對血液中的HIV-1進行檢測,最低檢出限能達到10-100copies/reaction;Nguyen等[45]用RT-LAMP對血液中的乙型肝炎病毒進行檢測,最小檢出限為2.218fg/μL;Gadkar等[46]設計了一種標記的環狀探針,在未與目標基因結合時保持淬滅狀態,在與目標基因結合后會發出強烈的熒光,從而實現對目的基因的特異性檢測。該技術被稱為自猝滅環熒光探針-環介導等溫擴增(fluorescenceofloopprimeruponselfdequenching),使用該方法檢測水痘帶狀皰疹病毒,最小檢出限為102copies/µL;Fang等[47]將LAMP技術整合至一個八通道微流體芯片中,通過實時測量吸光度值實現偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)的定量檢測,最小檢出限為10fg/µL。Jung等[48]將免疫層析試紙條與多重環介導等溫擴增技術結合,對幾種甲型流感病毒進行檢測,最小檢出限為10copies/reaction。其他應用[49-55]見表1。

  3.4LAMP在原生動物快速檢測中的應用

  原生動物大多是不致病的,只有極少數會引起疾病,如阿米巴變形蟲會引起阿米巴痢疾、孢子蟲會引起瘧疾等。Yan等[56]用LAMP法檢測家蠶卵中的家蠶孢子蟲,最低檢出限能達到10孢子/mL;Mwendwa等[57]用LAMP法檢測溶組織內阿米巴,最低檢出限能達到30pg/mL;Yang[58]用LAMP法檢測棘阿米巴,最低檢出限為10copies/25μL。Lass等[59]用LAMP法檢測空氣中的剛地變形蟲,最低檢出限為102卵囊/cm2(過濾網表面積);Adaszek等[60]用LAMP法檢測狗身上的犬巴貝斯蟲,最低檢出限為0.1pg/μL。其他應用[61-63]見表1。

  4總結與展望

  綜上所述,LAMP具有快速、簡便、特異性好、靈敏度高等優點,同時它也存在引物設計復雜、反應體系易污染、擴增產物難定量等不足。彌補LAMP的不足能夠使它更好地應用于檢測行業。因此,LAMP未來主要發展方向有,(1)進一步優化引物設計程序,降低引物設計難度。(2)與其他新技術結合,開發出更為廉價、準確、簡便的閉管檢測方法,避免氣溶膠污染。(3)尋找一種更為精確的核酸定量方法,解決LAMP擴增產物難以準確定量的難題。(4)開發廉價的檢測設備及檢測儀器設備的小型化和微型化。(5)與其他新技術結合,解決多重LAMP難以達到四重以上的局限,實現真正意義上的高通量檢測。

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